Préparation de matériel biomoléculaire
Techniques
Extraction des acides nucléiques, dosage, purification:
- Lyse des tissus par Tissue Lyser (broyeur à billes) et Tissue Ruptor
- Extraction à l’aide de kits appropriés
- Quantification par mesure d’absorbance à l’aide d’un NanoQuant PlateTM(TECAN) ou Implen Nanophotomètre
Contrôles qualité
Vérification d’intégrité :
- Contrôle par visualisation du profil électrophorétique sur gel d’agarose ou par électrophorèse en micro-capillaires (Plateforme Bioanalyzer 2100, AGILENT®ou Experion, BIORAD®). La qualité des ARN est ainsi associée à une valeur de RIN comprise entre 0 et 10
- Séquençage Sanger et alignement des séquences nucléotidiques
Analyses PCR / RCA PCR / qPCR / RT-qPCR
Techniques
• PCR pour amplifier et détecter
Par la technique de PCR, amplification et/ou détection de la présence de fragments d’ADN d’intérêt.
Equipement : Thermocycleur Biometra TRIO
• RCA PCR pour amplifier et détecter des molécules d’ADN circulaires
La Rolling Circle Amplification permet d’amplifier des génomes circulaires entiers tels que des génomes viraux circulaires ou de l’ADN mitochondrial présents en très petite quantité dans des échantillons complexes.
Equipement : Thermocycleur Biometra TRIO
Cette méthode repose sur les propriétés de l’ADN polymérase Φ29. Cette dernière possède une activité de proofreading (relecture) importante et une processivité lui permettant de polymériser plus de 70 000 nucléotides sans se détacher de l’ADN matriciel.
Les amplicons seront ensuite détectés et quantifiés spécifiquement soit par PCR en temps réel soit par des expériences de Southern blotting.
• PCR en temps réel pour quantifier
Par la technique de qPCR ou RT-qPCR, détection et quantification spécifiques d’une cible d’intérêt ou analyse de l’expression de gènes cibles. Smaltis vous propose d’étudier spécifiquement l’expression de gènes d’intérêt en quantifiant le nombre de messagers (ARNm) grâce à sa plateforme de PCR en Temps Réel, après une étape de Reverse Transcription permettant de convertir l’ARNm en ADN complémentaire (ADNc)
Equipement : Thermocycleurs RotorGene 6000 et CFX Connect
Contrôles qualité
• Validation de la méthode
– Identification des kits de quantification existants ou conception et design des amorces et sondes spécifiques (SyberGreen® ou TaqMan®)
– Vérification de la spécificité des amorces et des sondes
– Détermination et validation du choix des gènes de ménage
– Détermination des conditions d’amplification optimales
• Points de contrôle de la méthode
– Contrôle et ajustement des concentrations des échantillons
– Vérification de leur intégrité
– Détermination des efficacités de réactions pour chaque couple d’amorces
– Vérification de la spécificité des amplifications à l’aide de melting curves
