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Microbiote : exemple de réalisation

Accompagnement du développement d'un composé dans le cadre de la maladie de Crohn

Etude de l’interaction du composé EB8018 avec les bactéries intestinales responsables de la sur-inflammation aigüe chez les patients atteints de la maladie de Crohn.

Phase préclinique

Démontrer et valider in vitro l’interaction entre le composé et la protéine bactérienne FimH, un élément clé impliqué dans la sur-inflammation aiguë chez les patients souffrant de la maladie de Crohn

Procédure : Caractérisation d’une collection de souches AIEC (Adherent Invasive Escherichia coli) en termes d’adhésion aux cellules et d’agrégation avec le composé

ETAPE 1

Evaluer les propriétés d’adhésion et d’invasion de souches isolées chez les patients, sur une lignée de cellules intestinales, en présence ou en l’absence du composé

  • Test d’adhésion de 70 souches cliniques à la lignée cellulaire T84
  • Infection durant 2h, MOI 10 à 100
  • Monitoring de l’adhésion cellulaire par mesure de fluorescence après immumomarquage (Microscopie)

ETAPE 2

Développer un test d’agrégation pour visualiser l’interaction entre le composé et les protéines FimH des souches d’intérêt

  • Test d’agrégation effectué sur 110 souches cliniques
  • Culture bactérienne en présence de différentes concentrations du composé, pendant 5h
  • Visualisation des agrégats formés entre le composé et les souches (Lecteur de plaques multimode Spark 10)

Calcul du % d’adhésion des souches par mesure de la fluorescence

  • Identification des souches adhérentes
  • Parmi elles, identification des souches affectées par le composé (réduction de l’adhésion)

Identification de l’agrégation par visualisation qualitative
Catégorisation du niveau d’agrégation

  • Détermination des souches ayant agrégé
  • Détermination des concentrations effectives du composé
  • Corrélation avec les résultats obtenus en adhésion

Phase clinique

biopsies_projet Takeda

Créer un protocole pour isoler à partir de biopsies intestinales les bactéries “biomarqueurs”, puis confirmer et démontrer leur interaction avec le composé

Procédure : Caractérisation de souches issues de biopsies, en termes d’agrégation avec le composé

ETAPE 1

Développement d’une méthode pour isoler les bactéries “biomarqueurs” à partir de 114 biopsies intestinales : procédure sur mesure pour isoler et dissocier les bactéries “adhérentes” des bactéries “invasives” 

-Sonication : extraits et souches “adhérents”
-Lyse cellulaire à l’aide de billes : extraits et souches “invasifs”

ETAPE 2

Test d’agrégation sur les extraits et bactéries isolées de biopsies intestinales, avec le composé

Exemple d’images obtenues pour des souches témoins après 5h d’incubation

Analyse de l’agrégation sur les extraits de biopsies adhérents et invasifs puis sur les souches isolées
Pour les souches isolées présentant une agrégation, identification bactérienne par spectrométrie Maldi-Tof

  • Confirmation de l’interaction des bactéries « bio-marqueurs » avec le composé
  • Catégorisation des patients en fonction du comportement des souches en termes d’agrégation
  • Détermination du taux de patients pour lesquels une agrégation a été observée
  • Corrélation avec les données cliniques

LIVRABLES
› Modes opératoires développés sur-mesure
› Rapports d’analyses et échantillons biologiques caractérisés

 

VALEUR AJOUTEE
› Rapports et résultats conformes aux exigences réglementaires
› Sécurisation des données
› Poursuite du projet pour les essais cliniques de phase II