La plateforme de microbiologie dont s’est dotée Smaltis dispose des outils pour caractériser et quantifier les micro-organismes, qu’il s’agisse de bactéries, de levures ou de moisissures. Nous travaillons à partir de souches isolées, de solutions d’acides nucléiques ou de matrices plus complexes telles que des selles, des biopsies, des prélèvements de sols ou de surfaces.
Notre offre
Parmi les nombreuses méthodes disponibles pour caractériser et screener les germes microbiens, voici des exemples d’outils que nous utilisons et qui peuvent être employés dans des conditions aérobies ou anaérobies.
Identification
L’identification précise de micro-organismes, qu’il s’agisse de bactéries, de levures ou de moisissures est un préalable indispensable à de nombreuses analyses. Smaltis vous propose des solutions d’identification à travers différentes techniques de biologie moléculaire, les méthodes utilisées étant dépendantes des germes à identifier.
Spectrométrie de masse MALDI-TOF de Bruker
La spectrométrie de masse est une technique analytique permettant l’identification (genre et espèce) de micro-organismes en quelques minutes. Cette méthode rapide, dépendante des bases de données, est bien adaptée à l’identification de la plupart des bactéries responsables d’infections chez l’Homme ou l’animal.
Séquençage Sanger
Le séquençage Sanger est utilisé pour l’identification précise de souches peu décrites, de souches non-cultivables ou pour lesquelles la spectrométrie de masse n’est pas adaptée (levures et moisissures). En fonction des micro-organismes, nous ciblons des gènes spécifiques d’espèces que nous amplifions par PCR et séquençons. L’identification est ensuite réalisée par comparaison des séquences-cibles avec les bases de données internationales.
Séquençage haut-débit
Cette méthode peut être utilisée soit à partir d’un micro-organisme isolé soit à partir d’un microbiome.
Pour un micro-organisme isolé, la technologie employée (whole genome sequencing) consistera à séquencer l’ensemble du génome permettant à la fois l’identification de l’espèce et l’obtention de sa carte d’identité génétique.
Pour un microbiote (l’ensemble des micro-organismes peuplant un microbiome), la technique utilisée consistera à séquencer l’ensemble des allèles codant pour les sous-unités ribosomale 16S (ARN 16S), marqueurs génétiques les plus connus pour identifier et classer les genres bactériens. Pour les moisissures, le séquençage porte sur les régions ITS1 et ITS2. Par ailleurs, pour une identification à l’espèce, le séquençage peut porter sur l’ensemble des génomes microbiens dans leur totalité, grâce à la technique de shotgun.
Profil d'antibiorésistance
Grâce son expertise dans l’évaluation du phénotype de résistance bactérienne aux antibiotiques, Smaltis vous propose de déterminer le profil de résistance de souches d’intérêt.
Phénotypage
Après l’identification, la caractérisation précise de micro-organismes constitue une autre étape essentielle. En effet, les caractéristiques des souches utilisées dans vos projets conditionneront les résultats et leur interprétation. Pour mieux connaître les souches que vous étudiez, Smaltis vous propose de déterminer leurs caractéristiques phénotypiques (Morphologiques, Physiologiques, Métaboliques).
Détermination des caractéristiques morphologiques
L’étude de la morphologie d’un micro-organisme permet de vérifier la pureté d’une souche. Elle est basée sur l’étude de la morphologie des colonies et des cellules.
Smaltis vous accompagne ainsi dans :
– L’étude morphologique des colonies, une étude macroscopique (à l’œil nu) permettant d’en déterminer les caractéristiques, à savoir :
. La forme (ronde, entière, ondulée, zonée, filamenteuse…)
. La taille
. La couleur
. L’aspect (collant, filamenteux…)
. L’odeur
– L’étude morphologique des cellules, une étude microscopique pouvant se faire à l’état frais ou après coloration des cellules. Elle permet de distinguer :
. La forme cellulaire (sphérique (cocci), cylindrique (bacille), spiralée (spirille), enroulée (spirochète) ou filamenteuse).
. Le mode de regroupement (en chaînes comme les Streptococcus, en amas asymétriques ou grappes comme les Staphylococcus…).
. La taille
. La présence de spores
. La motilité (capacité à se mouvoir), par swimming, swarming ou twitching
Détermination des caractéristiques physiologiques et métaboliques
Chaque micro-organisme ayant des caractères biochimiques propres, Smaltis vous propose de les déterminer pour chacune des espèces par :
. La culture sur milieux sélectifs
. La réalisation de différents tests biochimiques (tels que les galeries API)
. La détermination de leur cinétique de croissance en fonction de différents paramètres (conditions de température, d’oxygénation, et de pH)
. La mesure de leur propension à former du biofilm en microplaques
Nous réalisons également ces prestations avec des levures ou moisissures.
Génotypage
Le typage moléculaire et le moyen utilisé pour la surveillance épidémiologique d’agents infectieux, les contrôles qualité de production ou la recherche de sources de contamination. Grâce à différentes méthodes, Smaltis vous permet de déterminer le génotype de vos souches et ainsi de vérifier leur clonalité (vérifier s’il s’agit ou non de la même souche).
MLVA
Le génotypage par MLVA (Multiple-Locus Variable number tandem repeat Analysis) repose sur l’amplification par PCR de plusieurs VNTRs (Variable Number of Tandem Repeat) dispersés sur le génome bactérien, à l’aide d’amorces spécifiques des régions flanquantes. La détermination des tailles des amplicons par électrophorèse permet ensuite d’évaluer le nombre de répétitions à un locus donné. La longueur des unités répétées étant connue, ces tailles reflètent le nombre d’unités répétées dans les régions amplifiées. Cette méthode de détermination d’empreintes génétiques augmente considérablement, pour certaines espèces, l’efficacité du génotypage bactérien. Le résultat du typage est un code numérique incluant le nombre de motifs à chaque locus.
Smaltis peut également vous proposer le séquençage de ces VNTR, il s’agit alors de génotypage par MLST (Multiple Locus Sequence Typing).
Electrophorèse en Champs Pulsé (PFGE)
Le génotypage par PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis) permet l’analyse des profils de macrorestriction de l’ADN total par électrophorèse en champ pulsé. Le résultat est un profil de restriction définissant un pulsotype caractérisant l’isolat bactérien étudié. La PFGE est une technique de typage standard pour de nombreuses espèces bactériennes du fait de son pouvoir discriminant élevé.
Mesure des facteurs de virulence
L’étude de l’activité et/ou de la production de facteurs de virulence est un élément clef permettant d’appréhender la pathogénicité de bactéries. Dans ce contexte, Smaltis vous propose de caractériser vos souches bactériennes en étudiant :
– L’activité de facteurs de virulence structuraux en particulier celle de déterminants impliqués dans l’adhérence et la motilité bactérienne. Il s’agit de structures telles que les pili ou les flagelles dont le fonctionnement peut être observé sur des milieux spécifiques.
– L’activité et/ou la production de facteurs secrétés tels que des toxines, des sidérophores ou diverses enzymes impliquées dans la colonisation et l’infection de l’hôte. Ceux-ci peuvent soit être mis en évidence sur milieux gélosés appropriés, soit être dosés selon des méthodes adaptées.
Evaluation de la cytotoxicité
L’évaluation de la cytotoxicité consiste à mesurer la capacité d’une bactérie à tuer les cellules. Cette quantification peut être réalisée sur différentes lignées cellulaires eucaryotes.
Sur les globules rouges en particulier, cette évaluation permet d’analyser la capacité hémolytique d’une bactérie.
La mort des hématies peut être ainsi mesurée par la libération d’hémoglobine, via la technique de Red Blood Cell Lysis, consistant à mettre les hématies en contact avec les bactéries, et de quantifier par dosage spectrophotométrique l’hémoglobine libérée. Cette détermination peut se faire en end-point, c’est-à-dire avec une mesure à un temps défini, ou en cinétique, permettant d’effectuer des mesures à différents temps.
D’autre part, l’évaluation de la capacité hémolytique des bactéries peut se faire par la culture des souches sur des géloses au sang. En cas d’activité hémolytique, les bactéries vont former des colonies entourées d’une zone claire, la lyse des hématies rendant en effet le milieu transparent. Cette transparence est totale si l’hémolyse est complète. En cas d’hémolyse partielle, on observe un léger trouble.
Sur les autres types cellulaires, la quantification de la mort cellulaire peut se faire par le dosage de la Lactate Déshydrogénase (LDH) libérée dans le milieu de culture suite à la destruction des cellules, ou par la mesure du clivage du MTT.
