L’amplification d’acides nucléiques par réaction de polymérisation en chaine, plus communément appelée PCR (Polymerase Chain Reaction ou Reaction en Chaine par Polymérase) est la technique de biologie moléculaire de référence permettant d’obtenir, à partir d’un échantillon d’acides nucléiques, un grand nombre de copies identiques d’un fragment d’ADN. Grâce à cette technique, SMALTIS vous propose d’amplifier et donc de détecter la présence de fragments d’ADN d’intérêt ou de molécules d’ADN circulaires.
L’utilisation d’agents intercalants de l’ADN ou de sondes fluorescentes durant la réaction de PCR permet également de quantifier en temps réel l‘augmentation du nombre de copies d’ADN nouvellement synthétisées. Par cette technique, appelée qPCR (quantitative PCR), SMALTIS peut détecter et quantifier spécifiquement une cible d’intérêt ou l’expression de gènes cibles.
Notre offre
Amplification par PCR puis séquençage
L’amplification et le séquençage de fragments d’ADN trouve de nombreuses applications telles que l’étude du polymorphisme génétique d’une cible d’intérêt, l’identification de mutations conférant des phénotypes particuliers ou encore la validation de séquences d’ADN plasmidique.
Quels que soient vos échantillons (plasmides, sang, culots cellulaires, micro-organismes…), Smaltis vous propose ses services pour contrôler vos séquences d’intérêt, de la purification des acides nucléiques à l’alignement des séquences nucléotidiques en passant par le design et la synthèse d’amorces spécifiques.
Les services incluent également diverses prestations complémentaires telles que la purification sur gel d’agarose ou la marche sur le chromosome.
Quantification de l'expression génique
L’analyse de l’expression des gènes est fondamentale dans de nombreux domaines de recherche et permet d’appréhender les changements dynamiques dans une bactérie, une cellule eucaryote, un tissu ou un organisme. En effet, si le génome est identique dans chacune des cellules d’un organisme donné, les gènes peuvent avoir une expression spécifique et différenciée dans le temps (propre à un stade de développement), dans l’espace (propre à un type cellulaire, tissulaire ou organique) et/ou caractéristique d’un état donné (normal, pathologique, en réponse à un stimulus…).
Smaltis vous propose donc d’étudier spécifiquement l’expression de gènes d’intérêt en quantifiant le nombre de messagers (ARNm) grâce à sa plateforme de PCR en Temps Réel, après une étape de Reverse Transcription permettant de convertir l’ARNm en ADN complémentaire (ADNc).
Suivant vos besoins, nos collaborateurs réaliseront votre projet selon plusieurs étapes :
Etape 1 : Etude de faisabilité
Cette étape comprend une revue de la littérature pour analyser les données déjà existantes et une analyse bio-informatique des séquences d’intérêt.
Cela permettra à nos experts :
– d’identifier des kits de quantification commerciaux existants ou de concevoir et dessiner des primers et des sondes spécifiques (SyberGreen® ou TaqMan®)
– de déterminer les gènes de ménage (House Keeping Genes)
– de mettre au point la méthode de qPCR
– de déterminer les conditions d’amplification optimales
– de vérifier la spécificité des primers et des sondes
– de valider le choix des gènes de ménage
Lors de cette étape, l’analyse d’un nombre limité d’échantillons sera également réalisée pour valider la méthode.
Etape 2 : Analyse de routine
Cette étape permet d’analyser l’ensemble de vos échantillons grâce à la méthode préalablement validée.
Notre plateforme équipée d’un RotorGene 6000 et d’un CFX Connect nous permet de traiter quelques échantillons à plusieurs centaines simultanément.
Exemples de réalisation
– Analyse de l’expression de gènes de virulence et de résistance chez des souches Klebsiella pneumoniae.
– Etude de l’effet inducteur des antibiotiques sur l’expression de systèmes d’efflux chez Pseudomonas aeruginosa.
– Détection d’ADN épisomique dans des échantillons de sang prélevés à l’aide de la technologie PAXGene®.
– Analyse de l’expression des gènes codant pour les cytokines IL-6, IL-8 et TNFα chez des cellules préalablement infectées par différentes souches bactériennes.
– Quantification de l’expression de différents transgènes dans des lignées cellulaires eucaryotes.
Amplification de molécules d'ADN circulaires par Rolling Circle Amplification
L’amplification d’ADN par Rolling Circle Amplification (RCA PCR) est une technique qui est notamment utilisée pour amplifier des génomes circulaires entiers tels que des génomes viraux circulaires, de l’ADN mitochondrial et des génomes microbiens d’une taille allant jusqu’à 6,5 Mb. Cette méthode repose sur les propriétés de l’ADN polymérase Φ29. Cette dernière possède une activité de proofreading (relecture) importante et une processivité lui permettant de polymériser plus de 70 000 nucléotides sans se détacher de l’ADN matriciel.
Grâce à cette technique, Smaltis vous propose d’amplifier spécifiquement par RCA des marqueurs ADN circulaires d’intérêt présents en très petite quantité dans vos échantillons complexes. Les amplicons seront ensuite détectés et quantifiés spécifiquement soit par PCR en temps réel soit par des expériences de Southern blotting.
Suivant vos besoins, nos collaborateurs réaliseront votre projet selon plusieurs étapes :
Etape 1 : Etude de faisabilité
Cette étape comprend une revue de la littérature pour analyser les données déjà existantes et une analyse bio-informatique des séquences d’intérêt.
Cela permettra à nos experts :
– de concevoir et dessiner des primers et des sondes spécifiques
– de mettre au point la méthode de RCA PCR sur vos échantillons
– de déterminer les conditions d’amplification optimales
– de vérifier la spécificité des primers et des sondes
– de mettre au point la méthode de détection et de quantification
Lors de cette étape, l’analyse d’un nombre limité d’échantillons sera également réalisée pour valider la méthode.
Etape 2 : Analyse de routine
Cette étape permet d’analyser l’ensemble de vos échantillons grâce à la méthode préalablement validée.
Exemples de réalisation
– Détection de virus endogènes Humains (HERV) à partir de culots cellulaires.
– Détection et quantification de virus endogènes Humains (HERV) à partir d’échantillons de sang prélevés à l’aide de la technologie PAXGene®.
